Kaj pa ostale molekule RNK?

Pozdravljene in pozdravljeni na nedeljskem znanstvenem oddihu v oddaji Frequenza della scienza. Današnja goveja župa se bo skuhala v dobri družbi; prepredli in prebredli bomo namreč pester svet ribonukleinskih kislin. 

Leta 2021 smo se z ribonukleinskimi kislinami, krajše RNK, največkrat srečali v povezavi s cepivi proti koronavirusni bolezni. Cepiva na osnovi mRNK so eno od prvih neposrednih srečanj s široko, pravzaprav kar globalno uporabo precej stare ideje – ideje o manipulaciji in vnosu genske informacije za zdravljenje človeka. Molekulska biologija je namreč v ozadju malodane vseh procesov v mreži metabolnih reakcij, še pogosteje pa jo povezujemo z razmnoževanjem, rastjo in razvojem. 

Evkariontske celice dedni material hranijo v jedru, v obliki dolgih zaporedij nukleinskih kislin, ki jim pravimo kromosomi; to je celoten genom nekega organizma. Poznamo sicer še mitohondrijsko DNK, ki pa je v jedru ni. Ker celice hranijo celoten genski zapis, bi morale načeloma znati izdelati tudi vse strukturne komponente, ki jih potrebujejo za normalno delovanje. V osrčju molekularne biologije je bilo še do nedavnega zelo okrnjeno razumevanje mehanizma izdelave teh proteinskih komponent – celice so kot sintezni laboratorij, ki vrši prepisovanje DNK v RNK in nato njen prevod v proteine – ti se torej oblikujejo po navodilih, zapisanih v DNK. Genski zapis pa se lahko med celicami razlikuje. Ko se celice delijo in pride do podvajanja genskega materiala, lahko pride do napak. Te ponavadi ostanejo neopazne oziroma jih popravijo celični popravljalni mehanizmi, v redkih primerih pa lahko mutacije vodijo tudi do različnih bolezenskih stanj.

V današnji oddaji se ne bomo posvečali zapletenosti razumevanja celotnega genskega materiala v vseh celicah evkariontov, med katere spadajo tako rastline kot živali. Celice vseh večceličnih organizmov opravljajo mnoge različne specializirane funkcije. Tako se tudi v vsaki celici izraža drug del genskega zapisa. A ta del genskega zapisa, na primer pri človeku, torej kodirajoči del dednine, predstavlja le dober odstotek celotnega zapisa in hrani navodila za izdelavo različnih proteinov. Ti pa imajo v celicah različne funkcije; lahko so namenjeni presnovi, medceličnemu sporočanju in ohranjanju celične strukture. 

Proteini so torej motor celice; kako pa pride do njihovega nastanka oziroma sinteze? Ko se DNK prepiše v informacijsko RNK oziroma mRNK, ta zapusti jedro in se na ribosomih s pomočjo prenašalne RNK ali tRNK in ribosomske RNK ali rRNK, ki gradi ribosom, prevede v zaporedje aminokislin, ki tvorijo osnovo za protein. To aminokislinsko zaporedje se potem v različnih celičnih procesih spremeni v končni protein. Veriga aminokislin zapusti ribosom in zavzame značilno tridimenzionalno strukturo, ki že lahko predstavlja funkcionalen protein. Pot je torej na videz preprosta – DNK v jedru se prepiše v mRNK, mRNK izven jedra pa se ob pomoči ribosomov in prenašalne RNK prevede v zaporedje aminokislin, ki se kasneje še preoblikuje v funkcionalen protein. 

V to zgodbo so bile torej poleg mRNK sicer vključene še nekatere molekule RNK. Te so na nek način skrbele za prenos navodil in izdelavo proteinov. Znanstvena skupnost jih je razumela kot neke vrste deklice za vse, ki so skrite nekje v ozadju in kot pridne mravljice opravljajo svoje delo. 

A v zadnjih desetletjih je prišlo do razcveta raziskovanja molekul RNK. Raziskovalec v laboratoriju za omrežja RNK na Kemijskem inštitutu, doktor Miha Milek, pojasni, kaj je omogočilo ta razcvet.

Miha Milek: To je tko ...

Molekula DNK je bolj stabilna od molekule RNK, kar ji omogoča varno hrambo dednine. Obstaja mnogo razlogov za njeno stabilnost, in sicer: razlike v kemijskih lastnostih osnovnih gradnikov – nukleotidov, prisotnost encimov, ki skrbijo za razgradnjo RNK, in sestava iz dveh vijačnic.

DNK ali deoksiribonukleinsko kislino sestavljajo med seboj povezani nukleotidi. Te sestojijo iz sladkorja deoksiriboze, ki se prek fosfatne skupine povezuje z drugimi deoksiribozami in tvori ogrodje vijačnice DNK, ter značilne dušikove baze, ki določa kemijske lastnosti nukleotida. Možni so torej štirje nukleotidi, ki se razlikujejo glede na dušikovo bazo. Označimo jih s črkami A, T, C ali G v nukleotidnem zaporedju. RNK oziroma ribonukleinsko kislino pa gradi hrbtenica iz sladkorja riboze, razlikuje pa se tudi v enem nukleotidu – namesto timina v njej najdemo uracil. Nukleotidno zaporedje RNK označimo s črkami A, U, C in G. Zaradi kemijskih lastnosti deoksiriboze je DNK bolj stabilna od RNK. Ker je vloga DNK varno hranjenje dednine, je stabilnost zanjo zelo pomembna. Poleg tega pa je RNK tudi bolj dovzetna za encimsko razgradnjo.

Molekula RNK se od DNK torej loči po tem, da je manj stabilna. RNK v celici namreč v primerjavi z DNK hitreje razpade in se razgradi. Dodatno stabilnost molekuli DNK zagotavlja tudi združevanje v “duplex” – vsem znano dvojno vijačno strukturo, ki pa za molekulo RNK ni tako značilna. Ta namreč pogosto nastopa zgolj v enoverižni obliki. Prav tako je v celicah mnogo ribonukleaz, ki med drugim poskrbijo tudi za razpad mRNK. 

DNK je sestavljena iz štirih že prej omenjenih nukleotidov – adenina, timina, gvanina in citozina –, pri molekuli RNK pa namesto timina najdemo uracil. Sinteza uracila je energetsko manj potratna, in ker, kot bomo slišali v današnji oddaji, prihaja do prepisovanja velikega dela genskega zaporedja v različne vrste molekul RNK, ohranjanje energije pride prav. 

DNK pa mora zadostiti pogoju, da čim manj verjetno pride do morebitnih napak in sprememb v genskem zapisu, ki služi kot osnova za vse proteine. Morda bi se bilo zato bolj primerno vprašati, zakaj v DNK ni prisoten uracil? Ravno pogoj – čim manj napak – odgovori to na vprašanje. Uracil lahko namreč nastane tudi z izgubo aminoskupine oziroma deaminacijo nukleotida citozina. Popravljalni mehanizmi, ki preverjajo, ali se DNK pravilno prepiše ob deljenju celic, tako ne bi uspeli ločiti pravega uracila od tistega, ki je posledica izgube aminoskupine pri citozinu. Obstoj timina v DNK tako zagotovi večjo stabilnost in robustnost molekule, kar pomeni tudi večjo odpornost na spremembe. Vsak uracil, ki ga morebiti zazna popravljalni mehanizem DNK, pa je tako hitro nadomeščen s citozinom. 

Informacijska RNK predstavlja obliko zapisa genske informacije, ki jo razume ribosom. V celici tako služi kot kopija navodil, ki jih ta potrebuje za izdelavo proteina v določenem trenutku. Ko enkrat izpolni svojo nalogo, lahko razpade ali pa je utišana. Ravno pri tem procesu so med drugim aktivne druge vrste molekul RNK. Poleg utišanja mRNK imajo druge molekule RNK še mnogo funkcij. Kot bomo slišali v današnji oddaji, vseh še ne poznamo. Med drugim se na primer iz DNK prepisujejo tudi dolge regije nekodirajoče DNK, s čimer dobimo nekodirajočo RNK.

Letos je v soju luči mRNK, a nikakor ne smemo zanemariti vseh drugih pomembnih odkritij na področju celotne biologije ribonukleinskih kislin. Z njimi se bomo spoznali po glasbenem premoru. Potopili se bomo v zapleten svet uravnavanja izražanja genov in pregledali, česa smo se naučili o sintezi proteinov v zadnjih dvajsetih letih.

Phoebe Bridgers - Kyoto

Po krajši zastranitvi v binarni svet digitalnih glasbenih arhivov se vračamo z raziskovanjem štiriške kode našega mesenega obstoja. Prvi del oddaje se je nanašal na eno izmed najstarejših dognanj genetske znanosti: da celice hranijo kopijo knjige receptov za izgradnjo proteinov. To pa nikakor ne pojasni razlik, ki so očitne že na prvi pogled: veke in trepalnice so iz drugega testa kot očesna zrkla, roženica pa je vselej edinstvena, celo v primerjavi enojajčnih dvojčkov. Kaj vse je tu na delu?

Genski material nekega človeka hrani vse spremembe prvotnega zapisa, ki so je tvoril z mešanjem zarodnih celic matere in očeta ob oploditvi, genom pa se nato modificira do trenutka naše smrti. Če začnemo na začetku: najprej je bilo jajčece in spermij, ob združitvi pa se je sprožila kaskada natančno programiranih reakcij, ki vodijo do oblikovanja pravega malega človeka in vsega, kar mu pripada. Nastanejo oči, od ust navzdol vodi prebavna cev, iz štrcljev rok se oblikuje par najpogosteje petih prstov, pa vendar – iz vsake celice lahko izoliramo identično zaporedje DNK. Očitno je, da so med živčnimi in jetrnimi celicami velike razlike – kaj torej usmerja raznorodni razvoj telesnih tkiv?

Z vprašanjem o spremembah na genomu, ki ne izvirajo iz razlik v genskem zaporedju, in na nivoju izražanja genov se ukvarja epigenetika. Gensko zaporedje je spočetka načeloma identično v vseh celicah, nato pa se dogajajo spremembe. Te spremembe se lahko prenašajo naprej skozi celične delitve in tudi na potomce. Ne gre torej le za spremembe v izražanju genov, ki so odziv na okoljske razmere. Epigenetika skuša pojasniti, kakšni so razlogi za razlike med celicami na nivoju genoma, posledično pa poskuša obrazložiti tudi razlike v njihovi funkcionalnosti. Celice v srčni mišici morajo izdelati proteine, ki omogočajo krčenje mišičnine, za razliko od imunskih celic, ki proizvajajo protitelesa in mišičnine za svoje normalno delovanje ne potrebujejo. Med razvojem srca so se morale zgoditi nekatere prilagoditve, zaradi katerih se lahko te celice osredotočijo na izdelavo mišičnih proteinov, in ne kar vseh, ki jih imajo zapisane v genski kuharici. To bi bilo namreč zelo neučinkovito in za organizem energetsko potratno. Več o epigenetskih prilagoditvah nam pove doktor Milek.

Miha Milek: Seveda, se pravi ...

Znanstvenice in znanstveniki so nakazali kar nekaj mehanizmov, ki uravnavajo izražanje genov: med njih sodijo mutacije, kemijske modifikacije na genomu, spremembe na proteinih, okoli katerih se navija DNK, in količina transkripcijskih faktorjev, pri regulaciji pa sodelujejo tudi različne oblike nekodirajoče RNK. O prilagoditvah pove Milek.   

Miha Milek: Epigenetika se meni zdi ...

20.000 genov, kolikor jih premore človekov genom, torej ne predstavlja zgolj nespremenljivega zaporedja genov. Oblikuje jih zelo natančno regulirano sosledje sprememb v funkcionalni mreži celičnih DNK in RNK, ki se spreminja glede na razvojno stopnjo tkiva ali organa. 

Vendarle pa se moramo zavedati, da kodirajoči del dednine, torej tisti, iz katerega nastajajo proteinski produkti, predstavlja zgolj poldrugi odstotek celotnega zapisa. Raziskave v prejšnjem stoletju so pokazale, da se tudi nekodirajoče regije prepisujejo v poliribonukleinske kisline, kar je pognalo obsežno raziskovanje in poglobljeno razumevanje njihove vloge v celicah in tkivih. V prvem delu oddaje smo že omenili prenašalno RNK in ribosomsko RNK, ki tesno sodelujeta z mRNK v procesu translacije v času sinteze proteinskih produktov, vendar poznamo tudi ločeno skupino kratkih nekodirajočih RNK.

Nekodirajoče RNK danes ne obravnavamo več kot nepotrebnega presežka, ki se po evolucijskem naključju še vedno prepisuje v RNK, potem pa v celici nima vloge; v obsežni in dobro organizirani celični regulatorni mreži je nekodirajoča RNK dobro raziskana in dopolnjuje naše vedenje o spremembah v celičnem razvoju. Eden izmed pomembnih procesov, v katerem sodelujejo kratki odseki RNK, na primer mikro RNK, je RNK-interferenca. Izraz pomeni kratko molekulo RNK, ki duši oziroma moti delovanje neke druge molekule RNK. Več o njeni vlogi pri regulaciji izražanja genov nam pove profesor Boris Rogelj, raziskovalec na Institutu Jožef Stefan. 

Boris Rogelj: Po enem določenem ...

Z vidika raziskav lahko z uporabo RNK-interference ugotavljamo funkcijo tega gena, z vidika terapije pa lahko zmanjšamo izražanje gena, ki bi bil nosilec patologije. Z vezavo interferenčnega kompleksa na molekule mRNK pride do cepitve tarčne molekule ali do inaktivacije mRNK. Poleg tega se prostoplavajoči kompleks veže tudi na virusno RNK, ki bi se znašla v okuženi človeški celici – deluje torej tudi kot protivirusna obramba. 

Ključno je torej razumevanje, da se različne molekule mikro RNK in drugih regulatornih mrež izražajo zgolj v določenih tkivih in samo ob določenem času. Pa vendarle, kdo regulira mrežo regulatorskih molekul? Pojasni doktor Milek.

Miha Milek: To je eno ...

Celice z diferenciacijo ohranijo izražanje zgolj funkcionalno pomembnih genov – živčne celice morajo prenašati elektrokemijske signale, in sicer ob primernem času in s pravo intenziteto. Raziskave genoma sicer ocenjujejo, da kratka nekodirajoča RNK nadzoruje izražanje približno dveh tretjin vseh genov, ki kodirajo proteine, kar ponovno priča o njihovem pomenu. Po glasbenem premoru bomo spoznali še drugo plat kratkih nekodirajočih RNK, in sicer težave, ki jih lahko prinese njihovo neravnovesje v tkivu, pa velik potencial za zdravljenje s pomočjo tovrstnih molekul. Ostanite na valovih Radia Študent.

Bernays Propaganda - Mojata Marija

Pozdravljeni in pozdravljene nazaj v ribonukleinski oddaji Frequenza della scienza, ki jo poslušate s kar 89,3 milijarde nevronov – približno toliko jih lahko namreč naštejemo v človeških možganih.

Do sedaj smo pokazali, da mikro RNK nadzira skoraj vse najpomembnejše aspekte evkariontske biologije: sodeluje v razvoju od zarodka do smrti organizma ter usmerja celično diferenciacijo, programirano celično smrt in proliferacijo v tkivih ter raznovrstne fiziološke procese. Pomembno je tudi, da se izraža samo v določenih tkivih in samo v določeni razvojni stopnji. Omenjene vloge majhne nekodirajoče RNK pa aludirajo tudi na možne težave, če je regulacija okvarjena, okrnjena ali celo pretirana. Pojavijo se lahko motnje v metabolizmu, normalnem razvoju tkiv in regulaciji celičnega cikla, kar vodi tudi v pojav rakavih obolenj. O tem profesor Rogelj.

Boris Rogelj: Lahko si zamislimo ...

Še vedno je pogosto mišljenje, da je geneza tovrstnih obolenj vezana zgolj na mutacije v genomu, dedno prenašanje okvarjenih genov ali izpostavljenost določenim kemijskim in fizikalnim dejavnikom tveganja, denimo kajenju ali UV svetlobi. Nedavni napredki v razumevanju epigenoma, ki nosi zapis vseh sprememb DNK in histonov, pa osvetljujejo še drugi pomemben vidik celičnega življenja, ki je v okoliščinah funkcionalne telesne homeostaze visoko regulirano, v primeru okvar pa nastopijo težave. Glede na to, da posamezni odseki mikro RNK navadno nadzorujejo izražanje tudi več odsekov na genomu, so lahko težave zelo raznolike.

Po drugi strani pa nam poznavanje regulatornih mrež RNK omogoča načrtovanje možnih novih pristopov k diagnosticiranju in zdravljenju patoloških stanj, ki so se do sedaj izmikala razumevanju. Presežek ali pomanjkanje neke nekodirajoče RNK je lahko direktno povezan s pojavom bolezni, lahko pa zgolj posredno kaže na dogajanje v tkivu. V tovrstnih raziskavah lahko hitro preverimo kavzalnost in ponudimo nove diagnostične ali terapevtske pristope. Na primeru RNK-interference nam koncept razloži profesor Rogelj.

Boris Rogelj: Omenili smo prej ...

V nadaljevanju poglavja o terapijah z RNK pritiče krajša razprava o boleznih in medikalizaciji. Določene okvare regulatorne mreže mikro RNK so lahko pogubne; pomenijo bolezni v absolutnem, nepovratnem smislu. V tem primeru je zdravljenje edina pot za podaljševanje življenja, če terapija sploh obstaja. Poleg tega mejnega primera pa seveda obstaja tudi mnogo bolj sivo območje, denimo razne metabolne motnje. Te lahko v različni meri poslabšajo kvaliteto in skrajšajo trajanje življenja, ne pomenijo pa akutne nevarnosti za življenje. 

Znanosti o zdravju poganja želja po raziskovanju in odkrivanju novih načinov zdravljenja in izboljšavah v tehniki zdravljenja ter po uvidu v logiko človekovih notranjih procesov. Pomen znanja, ki ga znanost pridela, pa lahko pogosto zelo prosto interpretiramo. Koncept medikalizacije opozarja na zgodovinsko potrebo po organizaciji odgovora ob odkritju nove kavzalnosti, ki je lahko zelo nekritično – kot da nakazuje problem, ki ga moramo reševati, ker ga pač poznamo. Z odpiranjem znanosti vedno novim dognanjem se je treba vprašati, kako definirati bolezen in kdaj ta postane problem, ki ga je treba reševati.

V kontekstu majhne nekodirajoče RNK se srečujemo predvsem s kroničnim pomanjkanjem ali presežkom neke mikro RNK, kar skušamo uravnavati z zdravili. Tovrstne terapije bi bile torej privlačne denimo za proizvajalce zdravil, ki si želijo kronične oziroma dolgoročne prodaje. Pomembni vprašanji pa ostajata: kolikšen je potencial tehnologije z majhno nekodirajočo RNK in ali z znanjem, ki smo ga že usvojili, naslavljamo tudi akutna področja zdravstva, kot je odpornost bakterij proti antibiotikom. Doktor Milek o prihodnosti raziskav na področju RNK.

Miha Milek: Jaz mislim da ...

Po krajšem odmoru se bomo posvetili še nekaterim drugim zanimivim vidikom RNK – ribonukleinske kisline lahko namreč v določeni meri spominjajo na delovanje proteinskih molekul, na primer s specifično vezavo, značilno za protitelesa. Ostanite na znanstveni frekvenci.

Parnepar - Čovjek Prosjek 

Zadnji del oddaje posvečamo raznim uporabnim vidikom molekul RNK. Če smo v prvem delu oddaje orisali pot od DNK do proteina, smo kasneje pokazali, katere druge naloge RNK opravljajo v zdravih celicah in kako se te obnašajo v primeru okvare. RNK lahko zlahka sintetiziramo v laboratoriju in ustvarimo nekatere zanimive funkcionalnosti. 

Primer takšnih molekul so aptameri, kratke enoverižne RNK, ki jih lahko primerjamo s protitelesi. Protitelesa so velike proteinske strukture, ki nastajajo v celicah B, sestavljajo pa jih zaporedja dvajsetih različnih aminokislin. Aptamerov v človeškem organizmu ne najdemo. So enostavnejše strukture, saj jih gradijo zgolj štiri osnovne nukleotidne enote, v osnovi enake kot pri RNK – adenin, uracil, gvanin in citozin. Seveda si v laboratoriju privoščimo uporabo netipičnih oziroma modificiranih nukleotidov, ki lahko izboljšajo vezavo ali delovanje.

Aptamere odberemo iz velikih knjižnic, zaradi česar lahko dosežemo visoko specifičnost in afiniteto do tarče, na primer proteinov. Tako kot protitelesa lahko prepoznajo specifične vezavne molekule, za kar potrebujejo dobro določeno tridimenzionalno strukturo. Zaradi majhnosti lahko dosežejo tudi regije proteinov, ki protitelesom niso dostopne, hkrati pa niso imunogeni, saj ne gre za proteinske molekule. Najpomembnejša prednost aptamerov pred klasičnimi protitelesi je enostavnost sinteze, ki ne zahteva kompleksnih celičnih linij, temveč osnoven sintezni laboratorij.

Zaradi teh lastnosti so aptameri dobra alternativa protitelesom v biokemijskih in imunskih metodah – uporabni so pri ločevanju sestavin, na primer iz kompleksnega biološkega vzorca, ali kot senzorji za prisotnost neke snovi v vzorcu. Osnovna ribonukleinska struktura aptamera služi kot sonda – med prebijanjem skozi tkiva in celice se preferenčno lokalizira okoli svoje tarče. 

Trenutno je v razvoju okoli deset aptamernih učinkovin, zaenkrat pa je samo ena prestala vsa klinična preskušanja, in sicer pegaptanib za zdravljenje degeneracije rumene pege na očesu. Z namenom izboljšanja zdravljenja bi lahko sicer na terapevtsko molekulo namestili še encime, kemijske markerje za celično uničenje ali interferenčno RNK. Aptamere pa lahko nadgradimo tudi tako, da jim dodamo komponento, ki deluje kot RNK stikalo – gre za zasnovo, ki omogoča enostavno aktivacijo ali deaktivacijo izražanja proteinskih produktov. Stikalo se odzove na vnos neke zunanje vezavne molekule, ki jo lahko raziskovalec oziroma raziskovalka enostavno doda preučevanemu vzorcu.

...

Po slišanem se morda komu zdi, da je svet RNK podrobno raziskan. A v celični in molekularni biologiji obstaja še mnogo neznank. Na njih nas opozori tudi raziskovalec na Kemijskem inštitutu Miha Milek.

Miha Milek: Je, pa res ...

Vsekakor se je preboj v uporabi molekule mRNK v cepivih in tudi v terapevtske namene napovedoval že veliko časa. Kot smo spoznali danes, pa informacijske RNK predstavljajo le del življenja celic. Z razvojem tehnologije je znanstvenicam in znanstvenikom uspelo na stežaj odpreti vrata v svet ribonukleinskih kislin. 

Iskanja v zadnjem času zanemarjanih ribonukleinskih kislin sta se lotila Zarja in Luka.

Brali sva Pia in Muri.

Tehniciral je Jaka.

Lektorirala je Teja.