helikaza ftw

PCR, kakor s kratico označujemo postopek verižne reakcije s polimerázo, je ključna metoda molekularne biologije. Omogoča nam medicinsko in forenzično diagnostiko, biotehnološke postopke in znanstveno raziskovanje nasploh. V današnjem Znanstvenem britOFFu poročamo, da je raziskovalna skupina iz Združenih držav Amerike razvila nov postopek za pomnoževanje števila kopij DNA, ki za razliko od PCR-ja ves čas poteka pri isti temperaturi.

Znanost / Frequenza della scienza

DNK? Milijonkrat, prosim.

Verižna reakcija s polimerazo ali skoraj revolucionarna metoda PCR

Urška Janžič

 / 20. 3. 2022

Če malo ponovimo, s kratico PCR označujemo postopek verižne reakcije, v kateri v treh korakih z encimom polimerázo pomnožimo določen odsek DNA-molekule. Kot vemo, je DNA sestavljena iz dveh vijačnic, ki ju vodikove vezi povezujejo v dvojno vijačnico. Če želimo DNA kopirati, moramo vijačnici najprej denaturirati, torej prekiniti vodikove vezi. To storimo s segrevanjem na 95 stopinj Celzija, s čimer dvojno vijačnico razklenemo na dve enojni vijačnici. V prvem koraku PCR-ja tako dobimo dve ločeni komplementarni verigi. 

V drugem koraku poteka pripenjanje primerjev na začetne odseke razprtih verig, za kar je potrebna temperatura 55 stopinj Celzija. V tretjem koraku pa temperaturo ponovno dvignemo na 72 stopinj Celzija, s čimer omogočimo, da encim polimeráza začne dodajati komplementarne nukleotide – gradbene enote DNA – na verige. Na ta način polimeráza podaljša molekulo DNA v dvojno verigo, ki je kopija oziroma pomnožek izbrane DNA-molekule. Za izvedbo PCR-ja je tako ključno, da vsak korak poteka pri določeni temperaturi. V praksi to omogoča naprava, imenovana ciklični termostat, ki temperaturo avtomatsko prilagodi vsakemu koraku.

Raziskovalna skupina iz ZDA je razvila postopek pomnoževanja DNA, ki lahko ves čas poteka pri isti temperaturi, dokler je ta v razponu od 37 do 65 stopinj Celzija. Ključna je predvsem sprememba v prvem koraku – za denaturacijo oziroma razprtje verig DNA je raziskovalna skupina namesto segrevanja uporabila modificiran encim helikáze bakterije Geobacíllus sterothermópilus.

Helikáza je protein, ki pri procesu podvajanja DNA v celici razpira dvojno vijačnico DNA. Raziskovalci in raziskovalke so helikázi dodali mutacijo, s čimer so dosegli, da encim DNA-vijačnico odvija do štirikrat hitreje – to je pomembno, ker večja hitrost odvijanja omogoči pomnoževanje daljših verig DNA – do dolžine 6 tisoč baznih parov. Poleg helikáze je raziskovalna skupina standardnim PCR-reagentom dodala še SSB-proteine, ki omogočajo stabilnost novonastalih enojnih verig. 

Raziskovalna skupina je primerjala, ali so produkti pomnoževanja DNA po obeh postopkih – torej klasičnem pomnoževanju s  postopkom PCR in pomnoževanju DNA z modificirano helikázo in SSB-proteini – med seboj primerljivi. Rezultati so pokazali, da se je nov postopek pri različnih tehnikah izkazal za enakovrednega klasičnemu PCR-ju, pri čemer je izkazal še dve praktični izboljšavi. Zaradi stalne temperature je reakcija, ki za razprtje verig uporabi helikaze, praviloma krajša, saj ni potrebe po konstantnem zviševanju in zniževanju temperature. S tem pa postane odvečna tudi uporaba cikličnega termostata oziroma PCR-mašine.

V članku predstavljen način pomnoževanja DNA lahko v prihodnosti zaradi svoje priročnosti postane univerzalni postopek DNA-pomnoževanja. Zaradi stalne temperature, ki odpravi potrebo po uporabi PCR-mašine, je poenostavitev procesa dobrodošla na vseh področjih znanosti, ki uporabljajo to metodo – teh pa, kot smo lahko slišali v uvodu, ni malo.

Slika: Wikimedia commons